推荐一篇发表在Nature Chemistry上的文章Electrochemical labelling of hydroxyindoles with chemoselectivity for site-specific protein bioconjugation，通讯作者是来自美国波士顿学院的Abhishek Chatterjee教授，主要研究方向是非天然氨基酸插入技术的开发和应用。电化学反应具有许多独特的优势，如反应参数可精确调控、反应条件温和、可扩展性强、可在原位生成活性中间体等等。利用实验室之前工程化改造的色氨酸tRNA合成酶-tRNA对，作者可以将与色氨酸类似的非天然氨基酸5-羟基色氨酸（5-hydroxytryptophan, 5HTP）定点插入到蛋白质中。本篇文章中，作者利用5HTP和芳香胺之间的电化学偶联反应eCLIC，开发了一种在温和条件下对全长蛋白进行位点特异性标记的方法。作者首先利用循环伏安法证明了5-羟基色氨酸的氧化电压显著低于天然芳香氨基酸；然后将5HTP定点插入蛋白，通过蛋白质质谱筛选了对5HTP进行电化学标记的偶联物和反应条件，发现一些芳香胺化合物，包括N, N-二甲基苯胺和对甲苯胺可以特异性地和5HTP形成偶联物，作者还通过更换缓冲液为HEPES和添加电子转移介质TEMPO进一步提高了标记效率。进一步地，作者合成了通过短聚乙二醇连接了末端炔、生物素和荧光基团的功能化苯胺，并证明它们能成功与插入了5HTP的蛋白特异性偶联。为了探索利用eCLIC修饰全长抗体的可行性，作者重组表达了抗HER2的曲妥珠单抗，并在重链的121位点特异性地插入了5HTP，随后用eCLIC反应对抗体进行标记；作者发现芳香胺探针能够选择性地标记重链上的5HTP，实现位点特异性的抗体荧光标记或药物偶联。接下来，作者测试了eCLIC反应与另外两种广泛应用的生物正交反应，SPAAC和IEDDA反应的兼容性。作者表达了sfGFP蛋白，在表面暴露的151位点分别加入了三种不同的非天然氨基酸：5HTP、AzK和CpK。作者发现每个非天然氨基酸残基只有在与其对应的偶联物存在时才能被修饰，从而证实了三个标记反应之间的正交性。最后，为了证明eCLIC和SPAAC可以在两个不同的位点选择性地标记同一个蛋白质。作者构建了插入了两种不同非天然氨基酸的sfGFP蛋白，5HTP和AzK分别位于位点3和151。作者首先通过eCLIC在该蛋白的5HTP残基上使用芳香胺探针1b进行标记，然后对AzK侧链进行SPAAC修饰，并通过质谱分析验证了插入非天然氨基酸的位点可以被顺序标记产生双重标记的sfGFP蛋白。因此，eCLIC反应可以与其他成熟的生物正交反应联用，实现精确的多位点蛋白标记。总之，作者利用非天然氨基酸5HTP插入技术，构建了一种通过电化学反应标记特异性蛋白位点的方法，该方法可用于标记全长蛋白，并与其他生物正交反应有良好的兼容性。
本文作者：ZCL
责任编辑：TZY
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41557-023-01375-y
文章引用：DOI:10.1038/s41557-023-01375-y
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