供稿：梁轩，北京大学

大家好，本期为大家分享一篇发表在 ACS Chemical Biology 上的文章，文章题目为“Biotin as a Reactive Handle to Selectively Label Proteins and DNA with Small Molecules”，文章的作者是来自美国加州大学旧金山分校的 Adam D. Cotton, James A. Wells 和 Ian B. Seiple 教授。本文中，作者发展了一种基于生物素对蛋白质和核酸等进行选择性标记的方法，称为生物素氧化还原激活化学标记 (Biotin redox-activated chemical tagging，BioReACT)，避免了亲和素的使用，能快速高效地在蛋白质或核酸上进行标记并引入生物正交基团。 

对生物大分子进行化学修饰意义重大，可以在蛋白质或DNA上引入正交反应基团或荧光标记基团，在 ADC 药物开发、生物标记成像等领域应用广泛。除了借助赖氨酸和半胱氨酸上的反应对蛋白质进行修饰之外，人们也开发出了基于甲硫氨酸的蛋白质标记方法。例如加州大学伯克利分校的 F. Dean Toste 教授和 Christopher J. Chang 教授等人在 2017 年发展的“ReACT” 策略（Science, 355(6325), 597–602.），该方法利用具有氧化性的氧氮丙啶试剂，选择性地和甲硫氨酸的硫醚反应生成亚磺酰亚胺，进而实现化学标记。然而这一标记容易发生水解，不够稳定，且需要在蛋白表面选择取向和位置适宜的甲硫氨酸才能进行有效的标记。

图 1. BioReACT 策略的思路和原理

为解决这一问题，作者借助生物素发展了一种与“ReACT”原理类似的策略（图 1）。生物素在生物分子偶联和标记领域应用广泛，但一般要与链霉亲和素搭配使用，然而链霉亲和素是一种分子量为 66 KDa 的四聚体蛋白，其较大的体积对很多生物物理实验具有潜在影响。如果将生物素与“ReACT”策略结合起来，则有望解决上述问题，为蛋白质标记提供一种广泛简便的方法。 

作者首先在小分子层面进行了反应可行性验证，用生物素甲酯和具有叠氮基团氧氮丙啶试剂在室温水相体系中反应，用 NMR 进行检测，当氧氮丙啶 1.5 倍当量时，仅需 20 分钟即可完全反应。接着他们在曲妥珠单抗的抗原结合片段 (Fab)上测试了该策略在蛋白层面的可行性，通过 Avi 标签在 Fab 上引入生物素，再用氧氮丙啶试剂标记，之后借助质谱检测（图 2）。

图 2. BioReACT 策略用于蛋白标记及稳定性分析

为了评估蛋白表面甲硫氨酸对标记的影响，作者将表面甲硫氨酸突变为亮氨酸进行对照，发现甲硫氨酸并不会引入额外的标记，反而 Fab 表面的的组氨酸和 N 末端给标记带来了一些背景。通过控制氧氮丙啶试剂的用量，可以很好地实现对 Fab 上生物素的选择性标记。接着他们将该方法与在 C 端甲硫氨酸上的标记反应进行了比较，发现在 biotin 上引入标记的反应更快（约 3.8 倍），且产物更加稳定，在 PBS 中孵育 10 天仍不会发生分解。 

在实际应用方面，作者首先将该策略应用到流式细胞仪术中，利用该方法在 anti-PD-L1 等抗体上引入叠氮基团，然后与 DBCO-Cy5.5 反应，实现了对 PD-L1 高表达细胞的流式分析。另一个应用是抗体偶联药物(ADC)的合成，将抗肿瘤药物 MMAF 与曲妥珠单抗的 Fab 偶联，得到的 ADC 能在 72 小时内选择性杀死 SKBR3 细胞（图 3）。

图 3. BioReACT 策略用于流式细胞术和ADC药物设计

最后作者将该方法拓展到核酸的标记，先在单链 DNA 的 5' 末端添加生物素，然后与氧氮丙啶试剂反应，通过 MALDI-TOF 进行检测，发现 25°C 的水相反应 1 小时即可实现有效标记（图 4）。

图 4. BioReACT 策略用于核酸标记

原创 ACS Publications ACS美国化学会

ACS Chem. Biol. 2021, DOI: 10.1021/acschembio.1c00252

Publication Date: August 19, 2021

https://doi.org/10.1021/acschembio.1c00252

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