Chem Sci: 放射性标记的Croconium克酮酸染料对脑斑块的靶向近红外二区光声和正电子发射断层扫描成像研究

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内容提要


目前大多数近红外探针存在信号转换低、光稳定性差、探针特异性差、功能受限等问题。本文设计合成了一种具有超高吸收性的近红外croconium克酮酸染料(CDA-3),该染料可特异地与β-淀粉样蛋白(Aβ)纤维的疏水通道紧密结合,在800 nm处有强吸收峰,低功率激光照射下可产生明显的局部温度波动,从而产生很强的光声信号。这种染料经过放射性18F标记后,可以对大脑皮质中的斑块进行超灵敏光声断层扫描(PAT)/正电子发射断层扫描(PET)/荧光三模式成像。PAT具有较高的空间分辨率和光学特异性,适合于成像皮质血管的病理部位;PET显示全身解剖,定量的生物分布信息,因此,本文报道的croconium克酮酸染料通过PATPET能够诊断和定位斑块。

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前言


近红外(NIR)染料以其高量子产量、良好的生物相容性和快速清除的特性在材料化学、光学成像和相关生物医学应用中得到了广泛的关注。近红外荧光(NIRF)成像由于其操作简单、成本低、实时监测等优点,被广泛应用于各种病理生理程序的检测和临床前应用。大多数近红外染料具有极低的疾病靶向性和结合能力,目前还没有合理或理想的方法来开发一种具有互补成像能力的近红外染料用于正电子发射断层扫描(PET)/光声断层扫描(PAT)PAT/ PET/NIR荧光在一个平台上。大脑淀粉样血管病(Cerebral amyloid angiopathy, CAA)常见于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)患者,其特征是β淀粉样蛋白(amyloid beta, Aβ)沉积于脑软脑膜动脉、皮层动脉和静脉壁。考虑到沉积可以同时或单独地发生在血管壁和脑实质中,因此制定一个精确的策略来确定体内CAA是至关重要的。作者设计了一个croconium克酮酸染料对β淀粉样蛋白足够的渗透率,靶向结合血小板在血管;具有很强的吸收近红外光谱范围内并产生一个更强的光声信号;该染料能够以较强的结合能与斑块的疏水性氨基酸强结合,显著地提高检测灵敏度,首次在转基因(Tg)小鼠模型中靶向斑块成像的评估。此外,利用18F标记的croconium克酮酸染料实现了体内的全身PET成像。本文的研究可能为早期检测脑斑块提供一种新的工具,并揭示神经血管功能障碍(如血管狭窄和破裂以及相关的痴呆)背后的确切机制。


结果与讨论


受芳香环-共轭桥-芳香环平面骨架结构的启发,作者报道了一系列具有croconium生物相容性染料(1ab)。具有电子给体-p-受体-p-供体结构的CDA具有良好的近红外吸收性能(CDA-1 604 nm, CDA-2 779 nm,CDA-3 798 nm)CDAcroconium环是一个稳定的环型中离子化合物,具有一个电子受体核和一个电子供体翅膀,导致了较强的近红外吸收(1c-e)。这两种噻吩结构也是给体电子给体,通过与疏水通道的结合促进了的高亲和力。如图1f所示,优化后的CDA化合物构型为梯形,两个亲水端基伸长。对接结果表明CDA-3位于Val18上方,与Lys16平行并倾斜,CDA-3的羧酸离子与赖氨酸的羧基之间形成氢键(1g)。目前大多数探针与6-- 2-(4-二甲氨基)苯咪唑[1,2-a]吡啶(IMPY)共用同一个位点,并嵌入疏水的Val18_Phe20通道。结果表明,CDA化合物严格地进入了结合袋。Lys16_Val18_Phe20亲疏水双通道纵向运行至纤维轴。随着单体数量的增加,随着纤维伸长,通道长度和潜在结合位点增加。因此,我们认为该结合位点主要负责CDA-31-40靶向结合。当CDA-31-40聚集体结合时,荧光强度增加,表明CDA-31-40聚集体之间存在明显的相互作用(1h)

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1 (ab)基于供体-受体-供体骨架的探针化学结构。(c) croconate染料的共振结构:双自由基和中离子型。(d)在水相B3LYP/6-31G (d, p)水平上对CDA-3进行几何优化后的电荷分布。(e) CDA-3的紫外-可见吸收曲线。(f) CDA-31-40纤维的分子对接结果。(g) CD-3原纤维上的构象。(h) CDA-3CDA-31-40聚集体相互作用时的荧光强度。

 

作者评价了croconium染料作为一种新的PA造影剂成像大脑中的斑块。将CDA-3PA性能与吲哚菁绿(ICG)、普鲁士蓝(PB)和金纳米棒(GNRs)等常用探针进行了比较。所有这些染料的吸收峰都落在近红外窗口(2a)。用808 nm激光(1.0 W cm-2)CDA-3溶液的温度从26℃迅速上升到63℃。在NIR激光照射下,溶液的紫外(UV)吸光度没有明显的变化。在相同的条件下,GNRsPB产生的升温幅度较小(2740℃) (Fig. 2 b2c)。花菁染料(ICG)有明显的缺点,如光漂白和热效应随时间的增加而损失(2c)。相比之下,ICGCDA中没有同时出现明显的吸收光谱变化。CDA作为一种具有优良光热效应的近红外有机染料,在800 nm脉冲激光照射下可以有效地产生PA信号(2d)。图2f显示了CDAPA信号的依赖性与浓度的关系。此外,我们将CDA与三种具有代表性的探针ICGPBGNRs进行了PA性质的比较。在相同浓度下,CDA提供的PA信号强度最高分别是ICGPBGNR1.4倍、1.5倍和4.5(2e)。利用人神经细胞(SH-SY5Y)进行MTT试验,研究CDA-3的生物相容性。图2 h显示,即使在相对较高的浓度0.5 mg mL-1, CDA-3的细胞毒性也可以忽略不计。

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2 (a) ICGPBGNRCDA-3在水溶液中的吸收光谱。(b) 808 nm激光照射下ICGPBGNRCDA-3和水的光热成像(1 W cm-210分钟)(c) (b) (d)不同浓度(1,0.5, 0.25,0.125, 0.063, 0.031, 0.016, 0.008 mg mL-1)CDA-3PA成像曲线。(e) 808 nm激光照射(1 W cm-110分钟)(f) PA信号强度与浓度的函数关系。(g)激光照射前后PA信号强度。(h)不同浓度的CDA-3与人神经元细胞系(SH-SY5Y)的细胞毒性

 

作者探讨了CDA-对脑血管中斑块特异性标记。对甲醛固定的WT(野生型)Tg小鼠的脑切片进行第一次抗体(6E10)染色,Tg小鼠的脑切片很容易被6E10标记。CDA-3染色的Tg老鼠和AD病人的大脑血管中的沉积和纤维化与硫磺素染色 (Th-S)非常吻合(3 ad)WT老鼠的大脑部分没有被明显标记。为了进一步检查血管上CDA-3对阳性斑块的影响,作者使用血管平滑肌细胞(VSMC)标记物(phalloidin-Alexa 594)对石蜡包埋的大脑切片进行染色。如图3bc所示,Tg小鼠血管中的沉积被VSMC标记物清楚地标记出来。

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3体外用CDA-3(a) Tg小鼠和(d) Cy5.5过滤网的人脑组织切片进行Ab斑块的荧光染色。(b)Alexa 594滤镜对Tg小鼠的血管平滑肌细胞进行phalloidin染色。(c)高倍图像显示血管段VSMC层排列严重破坏。用Th-S (a-d)标记同一切片上斑块的存在和分布。(a)(b)(d)中的比例尺为100 mM(d)中的比例尺为50mM

 

作为一种近红外荧光染料,使用不同的脑组织覆盖层(0, 1, 2,3 mm)检测CDA-3的穿透深度(4a-c)。随着脑组织厚度的增加,荧光强度明显减弱,但在3mm处仍可检测到,荧光强度的定量分析如图4d所示。为了检测CDA-3染料在体内的生物分布,我们进行了NIRF成像,尾静脉注射0.1 mg mL-1CDA-3给阿尔茨海默病(5-FAD)WT小鼠。从图4e和图4f可以看出,5-FADWT组。注射后4小时,5 -FAD组脑组织可见最大强度的荧光(4g)。然而,在WT组中,CDA-3的生物分布显示了一个可以忽略的大脑保留,这表明游离染料很快从体内被清除(4e)。这些结果表明高荧光信号在5-FAD小鼠可归因于CDA-3染料和β-淀粉样斑块之间的特异性结合能力。

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4大脑CDA荧光成像检测穿透深度。(a)白光;(b) CDA-3荧光成像;(c)荧光成像;(e) Tg小鼠和(f) WT小鼠静脉注射CDA-3 (0.5 mg kg-1)后不同时间点(0148 h)NIRF图像。(g)定量TgWT小鼠代表性时间点的相对荧光强度。

 

与荧光成像不同,PA成像可以通过超声波打破强光学散射,同时保持较高的穿透深度和空间分辨率。由于CDA-3在体外具有良好的PA性能,我们随后在CAA模型中研究了体内PA成像。图5显示了18F标记的CDA-3注射后不同时间点小鼠大脑的PA图像。从PA成像结果可以看出,在注射后1小时,功能化染料在CAA模型中比对照组积累得更好。在给药4小时后,CDA-3PA信号在Tg组的脑血管中显示明显的增强,提示高结合(5a)WT组的PA信号几乎与之前相同(5c)。为了进一步突出脑区,我们将不同时间点的PA图像减去注射药物前的原始PA图像,进行差分PA成像。如图5b所示,通过比较Tg组注射前和注射4h后的PA信号,可见矢状窦的增强PA图像对比度显著。而WT组在不同时间点的PA信号没有明显变化(5d)。这些结果表明,CDA-3复合物具有强大的能力,可以提高斑块增强成像对CAA的诊断价值。

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5 (a) Tg(c) WT小鼠静脉注射[18F]CDA-3后不同时间点PA最大振幅投影图像。(b) Tg(d) WT组小鼠大脑PA信号增强。(e) TgWT小鼠大脑中18F CDA-3PA信号强度(Y)和指定时间点PA(Tg)/PA(WT)的值(Y)

 

随着PET技术在临床中广泛应用于全身成像,作者探索了基于18FPET方法作为一种辅助成像技术。我们通过尾静脉注射了185 MBq/62.5 mg剂量的 18F CDA-3。从图6a中可以看出, Tg小鼠大脑中18F CDA-3分布清晰。由于缺乏Ab斑块,WT小鼠的大脑中很少有特异性结合。由于淀粉样蛋白特异性示踪剂, 18F CDA-3 PET显示Tg小鼠的脑血管摄取率约为WT组的2(6b)。由于PET没有组织穿透限制,在给药18F CDA-3后的1小时内,通过全小鼠获得了0.9 mm厚的连续冠状切片(6c)。然而,发现18F CDA-3显著尿化,Tg小鼠的断层成像显示18F CDA-3在脑内的三维分布明显,而不是WT组的低脑积累。综上所述,18F CDA-3是一种用于体内CAA监测和早期诊断的PET探针。

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6 (a)小鼠的多示踪PET成像。Tg小鼠被18FAV-45[18F]CDA-3 PET/CT排除,表明在大脑中聚集。18F FDG PET/CT显示Tg小鼠代谢低下。而WT小鼠正常,无沉积。(b) TgWT组对18F CDA-3的脑摄取。(c) TgWT小鼠18F CDA-3的全身PET成像。

 

结论


本研究探索了croconium克酮酸染料作为PET/PA/NIR荧光三模成像配体对脑斑块的选择性亲和性。CDA-3具有增强的近红外吸收、有效的光热特性、灵敏的PA反应以及全身PET成像等优点,在脑血管淀粉样蛋白监测方面发挥着重要作用,将为制定有效的CAA等脑血管疾病防治策略提供有力支持,将有助于研究大脑疾病的潜在机制。

 

参考文献


Yajing Liu, Yanping Yang, Mingjian Sun, Mengchao Cui, Ying Fu, Yu Lin, ZijingLi*, Liming Nie*, Highly specific noninvasive photoacoustic and positronemission tomography of brain plaque with functionalized croconium dye labeledby a radiotracer, Chem. Sci., 2017,8, 2710. 

DOI: 10.1039/c6sc04798j.

https://pubs.rsc.org/en/content/articlepdf/2017/sc/c6sc04798j


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