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分享的综述发表在Current Opinion in Chemical Biology上，标题为Chemoenzymatic strategies for RNA modification and labeling，通讯作者是德国明斯特大学的Andrea Rentmeister教授。
RNA在细胞中起着重要作用，包括转录、翻译和基因表达调控，为了揭示细胞中RNA的功能和代谢，RNA标记变得不可或缺。在这篇综述中，作者介绍了共价RNA标记领域的最新进展，重点对体外和细胞内的化学酶标记以及共转录和转录后RNA标记的代谢方法进行了介绍，并强调细胞成像、RNA分离和测序的相关应用。 首先作者分别介绍了不同RNA修饰酶在体外和细胞内的标记方法。在目前已知的RNA修饰中，很大一部分基于甲基或源自甲基，它们由RNA甲基转移酶生成（MTase），并使用S-腺苷甲硫氨酸（AdoMet或SAM）作为共底物。来自动物的MTase Hen1酶能使短的非编码单链RNA（ssRNA）的3’核苷酸甲基化。使用截短黑腹果蝇Hen1（DmHen1）的变体和AdoMet类似物合成siRNA，在铜催化的叠氮反应和炔的环加成反应(CuAAC)作用下对siRNA进行荧光标记(图1a)。如果在AdoMet类似物上的硫原子直接带上Cy3荧光团可以实现RNA的一步标记(图1a)。作者还介绍了RNA甲基转移酶METTL3/14和METTL16，这两种METTL可以分别标记单个转录物中的不同位点(图1a)。另外RNA去甲基化酶FTO可以辅助m6A选择性化学标记，这种方法称为m6A SEAL。FTO使m6A中的甲基羟基化，用二硫苏糖醇（DTT）处理后生成N6-二硫代硅醇甲基腺苷（dm6A），硫醇基可用于偶联生物素标记以进行亲和纯化(图1b)。除此之外，在NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）选择性步骤中可以使用腺苷二磷酸核糖环化酶（ADPRC），该酶可以用炔醇取代NAD+的烟酰胺基(图1c)，并通过使用不同的标记试剂进行纳米孔测序（NAD-tagSeq）。另一种标记方法是使用与模板无关的Poly(A)聚合酶（PAP）和3’末端尿苷基转移酶（TUT酶），这些酶能标记靶向RNA的3’末端，为了可视化固定化细胞和活细胞中的mRNA，可以通过3'末端多聚A尾的酶修饰来完成mRNA标记(图1d)。因此RNA修饰酶的化学酶标记技术可以用于体外和细胞内RNA的可视化、分离和测序。 图1 基于RNA修饰酶的化学酶标记技术 接下来，作者介绍了共转录代谢标记，这种标记基于代谢性RNA前体的细胞摄取。细胞特异性RNA标记的核苷类似物可耐受三磷酸核苷酸（NTPs）中的某些非天然修饰，然而，由于NTPs不是细胞可渗透的，因此需要用渗透的核苷类似物来进行补救途径。尿嘧啶磷酸核糖基转移酶（UPRT）可以将4-硫代尿嘧啶（4SU或TU）转化为NMP类似物（4SUd）。然而，内源性UPRT和尿苷单磷酸合酶（UMPS）能被转化为尿嘧啶类似物而干扰外源性UPRT/4SU的特异性。为了克服这一限制，最近对一种新的内源性酶/核苷系统UCK2/2’AzUd进行了表征。尿苷/胞苷致活酶2（UCK2）可以磷酸化2’-叠氮尿苷（2’AzUd）为UMP类似物，来对2’-AzUd标记的RNA成像或富集(图2a)。脱氧胞苷激酶（dCK）和2’-叠氮胞苷（2’AzCd）在dCK过表达时能对rRNA进行代谢标记(图2a)。另外核苷类似物的化学转化可以用来进行测序的应用，如硫尿苷到胞苷测序（TUC-seq）在cDNA测序读数中利用4SUd-to-C转换，用4Sud来进行代谢标记(图2b)。该方法最近通过将4Sud-to-C转化与6SG-to-A转化相结合而得到了改进(图2b)。 图2 通过核苷类似物供给和补救途径进行代谢RNA标记 最后作者介绍了转录后代谢标记，这为使天然RNA修饰的测序分析提供了一种有效的方法。作者开发了一种代谢标记方法来测定RNA中的m6A位点。对MTase介导的HeLa细胞RNA中m6A位点炔丙基化并用生物素点击标记后，可以测定出28S和18SrRNA中的m6A位点(图3a)。同时，Shu等人开发了一种m6A标记序列来确定m6A在基因中的位置，向细胞中添加氨基酸Se-烯丙基-L-烯丙基同型半胱氨酸，通过MTases在体内引入烯丙基侧链，然后用抗N6-烯丙基腺嘌呤（a6A）的抗体进行亲和纯化，最终在m6A位点上留下cDNA突变(图3b)。 图3 通过添加非天然氨基酸对RNA甲基化位点进行代谢标记 综上所述，在这篇综述中作者首先提出了对于体外或固定细胞中的RNA标记，化学酶法通常是最优的方法，它能有效地将位点特异性与功能化标记探针的模块化工具箱相结合。其次说明了共转录代谢标记方法在补救途径方面的改进为细胞特异性标记提供了可靠的解决方案。最后阐述了转录后代谢标记方法可以实现对活细胞位点的特异性标记。沿着这些路线，RNA聚合酶对非天然碱基对的位点进行特异性结合后可能在光交联、荧光标记等应用领域产生重要的影响。 文章编号：121 原文链接： https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2021.01.008 原文引用： Johanna Mattay, Maria Dittmar and Andrea Rentmeister*. Chemoenzymatic strategies for RNA modification and labeling. Curr Opin Chem Biol, 2021(63): 46-56.
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