JACS| 一种在缺氧环境中可调节活性的肺表达mRNA传递平台

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分享一篇发表在JACS上的文章,题目为“A Lung-Expressing mRNA Delivery Platform with Tunable Activity in Hypoxic Environments”。mRNA传递平台通常在静脉注射后促进肝脏中的蛋白质表达,并已优化用于正常氧合细胞。许多疾病的特征是缺氧,可使mRNA治疗的疗效降低80%以上。在这里,作者报道了一个用于mRNA递送的可调节肺表达纳米颗粒平台(TULEP),在缺氧环境下能有最佳表达。简而言之,作者的研究从一种新型氨基丙烯酸酯聚合物的合成和表征开始,这种聚合物可以有效地与mRNA有效载荷络合成TULEPs。作者研究了利用TULEP传递mRNA的功效和机制。然后,作者评估了缺氧条件下的TULEP,并通过使用ATP调节来解决缺氧相关的功效缺陷。最后,作者分析了TULEP平台在小鼠体内的mRNA表达、生物分布和耐受性。

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为了开发一种肺表达和缺氧可调的mRNA PNP,作者首先设计并合成了一种新型的氨基丙烯酸酯(AA)聚合物,通过在温和的反应条件下将低分子量支化聚乙烯亚胺(PEI)与6-碳炔酸盐尾部反应。这种新型聚合物结合了几种可能有利于mRNA递送的结构设计特性,(1)高胺密度促进与mRNA的有效络合,(2)酯键促进耐受性,(3)疏水尾巴促进自组装,(4)基于聚乙烯亚胺(PEI)的化学促进递送到肺部,(5)可调节性,使其活性可以在常氧和缺氧条件下进行优化。接下来,作者研究了新型AA聚合物将mRNA有效载荷复合到TULEP中的能力。作者首先通过AA聚合物和编码萤火虫荧光素酶(FLuc)报告基因的mRNA混合来制备TULEP;然而,该制剂在PBS中缺乏稳定性,因此被认为不适合长期使用。为了解决这个问题,作者假设在配方中添加PEG衍生物可以提供更好的稳定性,同时还可对 TULEP 的特性进行调节,这可能对mRNA递送很重要,包括其大小、电荷和封装效率。为此,作者制定并表征了一系列具有不同PEG摩尔比、顶部基团、PEG分子量和N/P比的TULEPs。还进行了透射电子显微镜以评估TULEP的表征。在对这些数据进行集体分析时,出现了几个趋势。首先,增加PEG的摩尔比或PEG尾部的长度导致PNP大小的普遍减小,而顶部基团对大小的影响最小。其次,在PEG摩尔比、顶部基团和分子量的变化对电荷的影响不大。第三,所有研究制剂的mRNA封装率均大于80%。第四,用PNP制剂处理的A549细胞的FLuc表达水平和活力受PEG 摩尔比、顶部基团和分子量的影响。基于这些结果,作者选择使用0.25 mol%的PEG百分比、C14 PEG顶部基团和PEG分子量1K、2K、3K和5K进行实验,因为这些设计表征在各自的参数研究中产生了最高的mRNA表达水平(如图1)。

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图1

基于这些功效结果,作者随后研究TULEP在体外递送mRNA的机制。包裹在纳米颗粒中的mRNA要在处理过的细胞中表达,纳米颗粒可以经历几个步骤,包括细胞结合(纳米颗粒与细胞膜相互作用)、内吞作用(纳米颗粒通过各种途径被吸收到细胞中)和内体逃逸(纳米颗粒从内体/溶酶体释放到细胞质中)。因此,作者通过对TULEP进行细胞关联实验开始了作者的机理研究。简而言之,这些研究是通过用具有可变PEG分子量的荧光标记(Cy5 FLuc mRNA)TULEP配方处理A549细胞来进行的。然后,在2小时和24小时对每个TULEP配方的Cy5阳性A549细胞的百分比进行定量,作为基准对照,还对用Cy5 FLuc mRNA封装的 Moderna LNP 配方处理的A549细胞进行了相同的实验。在共同分析这些结果时,观察到每种TULEP配方与A549细胞的细胞关联性都高于Moderna LNP 配方基准。

然后进行内吞途径机制研究,是通过用具有可变PEG分子量的荧光标记(Cy5 FLuc mRNA)TULEP配方处理A549细胞(其内吞途径被分子抑制剂抑制)进行的。然后确定每种配方的有效抑制率(即抑制与非抑制Cy5+ A549细胞的比率),作为基准对照,还使用Cy5 FLuc mRNA封装的 Moderna LNP 配方进行相同的实验。在分析这些数据时,观察到用 TULEP处理的Cy5+ A549细胞的百分比仅受细胞松弛素D的影响,而用 Moderna LNP处理的Cy5+ A549细胞的百分比受所研究的4种抑制剂的影响。这些结果表明,A549细胞可能利用内吞作用作为TULEP的一种特定途径。在此基础上,作者下一步试图利用定性和定量方法研究A549细胞中TULEPs的内体逃逸特性。作为基准对照,同样的共聚焦成像实验也用Cy5 FLuc mRNA包封的Moderna LNP制剂处理A549细胞。对这些数据的分析揭示了两个关键观察结果:首先,PEG分子量影响TULEPs处理的A549细胞的PCC值;其次,含有C14 PEG 1K和2K的TULEP配方的PCC值低于Moderna LNPs。综上所述,这些结果表明,相对于Moderna LNP制剂,选择的TULEP制剂在A549细胞中表现出更好的内体逃逸特性(如图2)。

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图2

作者试图更好地了解V-ATP酶(一种质子泵,可以促进质子流入内体/溶酶体并影响质子海绵效应)的抑制如何影响TULEPs的内体逃逸。为了评估这一点,作者试图利用流式细胞术来评估表达传递mRNA的处理细胞百分比的减少。为此,作者选择在本实验中传递Cy5标记的编码增强绿色荧光蛋白(EGFP)的mRNA(考虑到EGFP可以使用流式细胞术检测)。作者用可变PEG分子量的荧光标记(Cy5 EGFP mRNA)包封TULEPs处理A549细胞(其V-ATPase活性被巴菲霉素A1抑制)。然后,作者量化EGFP+ A549细胞减少的百分比,作为内体逃逸减少的测量,导致EGFP mRNA翻译减少(如图3)。作为对照和基准,在使用Cy5 EGFP mRNA包封的Moderna LNP制剂处理的A549细胞中,也量化了这一百分比的降低。在此基础上,作者还试图了解同时抑制V-ATPase和特定细胞摄取途径如何影响TULEPs的活性。为此,作者同时用巴菲霉素A1和一种抑制剂(filipin)处理A549细胞,以抑制小窝蛋白介导的内吞作用;Pitstop 2 -抑制网格蛋白介导的内吞作用;EIPA -抑制巨红细胞增多症;或细胞松弛素D -抑制吞噬作用)。然后用可变PEG分子量的荧光标记(Cy5 EGFP mRNA)封装的TULEPs处理这些被抑制的细胞群,并量化每组EGFP+细胞的减少百分比,以及类似的Cy5 EGFP mRNA封装的Moderna LNP基准对照。在对这些数据进行集体分析时,观察到两个关键发现。首先,巴菲霉素A1的抑制作用普遍降低了EGFP+ A549细胞中TULEPs的百分比,这表明V-ATPase活性可能在A549细胞中TULEPs的活性中起作用。值得注意的是,在使用Moderna LNP基准对照处理的细胞中,这种减少明显更高,这突出表明TULEPs和Moderna mRNA LNPs可能利用不同的内体逃逸机制途径。其次,与PEG分子量无关,TULEP的活性受到细胞松弛素D和巴霉素A1抑制的影响最大,这表明吞噬途径和V-ATPase活性可能对作者的TULEP平台的机制活性都很重要。为了进一步证实这些发现,作者还试图研究一种无标记方法(即TULEP制剂中不存在荧光团的方法)。简而言之,在用具有可变PEG分子量的 FLuc mRNA TULEP或 FLuc mRNA封装的Moderna LNP基准对照处理后,使用共聚焦显微镜对浸渍钙黄绿素(一种膜不可渗透的绿色染料,仍被捕获在完整的内体内体内,但如果内/溶酶体破裂,则分布在整个细胞中)浸渍的A549细胞。同样的成像方法也对单独用巴弗洛霉素A1抑制的钙黄绿素浸渍的A549细胞或用巴弗洛霉素A1 和细胞松弛素D抑制,这些细胞也用TULEPs处理。对这些图像的集体分析表明,钙黄绿素在非抑制的A549细胞中在整个细胞中的扩散最大,进一步强调了吞噬途径和V-ATP酶活性对TULEP活性的可能重要性。

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图3




本文作者:FSY

责任编辑:TZM

DOI: 10.1021/jacs.4c04565

原文链接:https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.4c04565


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